Introduction
Pichia pastoris est une levure tolérante au méthanol, largement utilisée pour l’expression de protéines recombinantes. Cette levure peut utiliser le méthanol comme seule source de carbone et d’énergie, ce qui en fait un choix privilégié pour les bioprocédés industriels. Comme d’autres levures, P. pastoris existe principalement sous forme haploïde lors de la croissance asexuée. Dans des conditions de nutriments limités, des cellules haploïdes de différents types de reproduction peuvent fusionner en cellules diploïdes, favorisant ainsi la diversité génétique.
Étapes clés de la fermentation du pichia pastoris
- Prolifération et reproduction cellulaires
La croissance initiale se produit dans un milieu riche en nutriments, permettant aux cellules de levure d’atteindre une densité appropriée pour un traitement ultérieur. - Étape de transition de l’alimentation par lots (glycérol ou glucose)
Cette étape implique l’ajout contrôlé de glycérol ou de glucose, qui sert de source de carbone avant de passer à l’induction à base de méthanol. - Étape d’induction de l’expression (méthanol) : le méthanol est introduit comme principale source de carbone, déclenchant l’expression des protéines recombinantes. Le débit d’alimentation en méthanol est soigneusement régulé pour maximiser le rendement.
Chaque étape repose sur une source de carbone soigneusement contrôlée, et la dynamique du taux de réapprovisionnement joue un rôle crucial pour garantir une expression efficace des protéines.
Avantages et inconvénients du pichia pastoris
Avantages
- Promoteur AOX1 puissant : le promoteur du gène de l’alcool oxydase (AOX1) est l’un des promoteurs les plus puissants et les plus étroitement régulés, garantissant une expression de haut niveau.
- Haute efficacité d’expression : l’expression des protéines recombinantes peut constituer plus de 90 % de la teneur totale en protéines, simplifiant ainsi la purification.
- Culture rentable : une fermentation à haute densité peut être réalisée dans des milieux synthétiques simples, réduisant ainsi les coûts de production.
- Intégration stable du génome : les plasmides d’expression s’intègrent dans le génome, permettant une production de protéines stable et fiable.
- Croissance sélective sur méthanol : Comme la plupart des micro-organismes ne peuvent pas utiliser le méthanol, les risques de contamination sont réduits.
Inconvénients
- Cycle de fermentation prolongé : par rapport aux systèmes bactériens, la fermentation par levure nécessite des temps de traitement plus longs.
- Problèmes de sécurité : le méthanol est inflammable, explosif et toxique, ce qui nécessite des protocoles de manipulation stricts.
- Coûts de criblage élevés : la sélection de souches à haut rendement implique des médicaments de criblage coûteux.
- Défis d’optimisation : les milieux de culture et les conditions de fermentation nécessitent un raffinement continu pour des applications spécifiques.
Facteurs clés influençant la fermentation de Pichia pastoris
Plusieurs paramètres affectent significativement l’efficacité de la fermentation de Pichia pastoris :
1. Température
Pichia pastoris prospère à une température comprise entre 25 et 30 °C, la fermentation optimale se produisant à 30 °C. Les fermentations industrielles maintiennent généralement des températures entre 30 et 35 °C. Un dépassement de cette plage entraîne une inactivation des enzymes, un vieillissement prématuré des levures et une réduction de l’expression des protéines.
2. Régulation du pH
Cette levure peut se développer dans une large plage de pH (2,0–7,5). Cependant, le pH idéal pour la fermentation industrielle se situe entre 4,5 et 5,5. Maintenir un pH optimal minimise l’activité des protéases et prévient la dégradation des protéines. L’eau ammoniacale est couramment utilisée pour ajuster le pH tout en servant de source d’azote.
3. Concentration de glucose
Des concentrations initiales de glucose supérieures à 25 g/L ont un effet inhibiteur sur la croissance des levures. La concentration initiale optimale de glucose se situe autour de 20 g/L, favorisant une prolifération cellulaire efficace.
4. Oxygène dissous (OD)
En tant qu’organisme aérobie, Pichia pastoris a besoin d’oxygène pour sa croissance et son métabolisme. Pendant la fermentation, l’oxygène dissous est généralement maintenu à 30 %, tandis que pendant l’induction au méthanol, il est réduit à 20 %. Un manque d’oxygène limite la croissance cellulaire, tandis qu’un excès d’oxygène dissous peut entraîner un stress oxydatif et une toxicité cellulaire.
5. Densité cellulaire
La concentration cellulaire initiale a un impact direct sur les performances de fermentation. Des concentrations initiales plus faibles entraînent une croissance plus rapide, mais une expression protéique plus faible. À l’inverse, des concentrations initiales plus élevées ralentissent l’utilisation du substrat tout en augmentant le rendement protéique. Lors de l’induction au méthanol, les concentrations cellulaires bactériennes sont maximisées pour s’adapter au méthanol et prévenir la toxicité. L’induction est généralement interrompue lorsque le poids humide atteint 180–220 g/L.
6. Source d’azote
Les sources d’azote organique, telles que la peptone, sont utilisées dans les milieux de culture des semences, tandis que l’eau ammoniacale sert à la fois de régulateur de pH et de source d’azote pendant la fermentation.
7. Sels inorganiques et oligo-éléments
Les nutriments essentiels comprennent CaCl2, MgSO4, K2SO4, KH2PO4 et K2HPO4. De plus, des oligo-éléments tels que le zinc, le cobalt, le manganèse, le molybdène, le cuivre et le fer sont essentiels à l’activité enzymatique. Bien que ces éléments favorisent la croissance des levures et la synthèse des protéines à faible concentration, des quantités excessives peuvent entraîner une toxicité et inhiber la fermentation.
Conclusion Pichia pastoris est devenu un système précieux pour la production de protéines recombinantes en raison de sa grande efficacité d’expression, de sa rentabilité et de sa capacité à effectuer des modifications post-traductionnelles. Cependant, l’optimisation des conditions de fermentation, notamment la température, le pH, les niveaux d’oxygène et la composition nutritionnelle, est cruciale pour obtenir un rendement et une efficacité optimaux. Malgré certains défis, la recherche et les avancées technologiques en cours continuent d’améliorer les capacités de Pichia pastoris en biotechnologie industrielle.
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