Det senaste återupplivandet av intresset för mikrobiell fermentering för produktion av biologiska läkemedel kan tillskrivas flera nyckelfaktorer. Framsteg inom biokemi och en djupare förståelse av glykosyleringsprocesser har särskilt belyst scenarier där glykosylering kan vara oönskad. Denna utvecklande kunskap har banat väg för innovativa metoder inom tillverkning av biologiska läkemedel. Framväxten av nya proteinformat och byggnadsställningar som sömlöst anpassar sig till mikrobiell jäsningsteknik har ytterligare underblåst denna trend. Dessa nya strukturer förbättrar inte bara effektiviteten av produktionen utan utökar också tillämpbarheten av mikrobiella system för generering av DNA-plasmider. Genom framgångsrika optimeringsinsatser är det nu möjligt att utveckla skalbara jäsningsprocesser som inte bara uppnår höga titrar och produktivitet utan också uppvisar anmärkningsvärd stabilitet och tillförlitlighet.
Under de rätta omständigheterna är detta tillvägagångssätt ett mycket attraktivt alternativ för produktion av biologiska läkemedel. Flera utmaningar återstår dock att lösa. Bakterier och jäst saknar vanligtvis det cellulära maskineriet som krävs för att bearbeta komplexa biologiska strukturer. Denna begränsning understryker den kritiska vikten av att välja det mest lämpliga produktionssystemet för varje målmolekyl. Ett betydande hinder är dessutom den otillräckliga förståelsen av uttryckssystemen och processerna som är involverade, vilket komplicerar produktionen av proteiner som uppfyller både kvantitets- och kvalitetskrav. Lyckligtvis, när branschen fortsätter att ta till sig mer känslig teknik, finns det nu en oöverträffad möjlighet att få insikter om produktkvalitet i tidigare utvecklingsstadier. Detta framsteg möjliggör en mer grundlig förståelse för hur man uppnår önskade kvalitetsegenskaper från början. Men det kräver också fler iterationer under utvecklingsfasen för att säkerställa att dessa kvalitetsriktmärken uppfylls tidigt i processen.
Skalning av mikrobiell fermentering innebär en mängd utmaningar, särskilt inom områdena processkontroll, syreöverföring och värmehantering. Dessa faktorer är avgörande för att optimera tillväxtförhållandena, särskilt för snabbväxande bakteriekulturer. För att maximera tillväxthastigheten är det viktigt att säkerställa tillräcklig syretransport genom hela odlingssystemet. Detta krav kräver effektiv blandning och lämplig luftflödeshastighet. Otillräckligt syre kan hindra mikrobiell metabolism, vilket i slutändan påverkar avkastningen och produktiviteten. Värmehantering är en annan kritisk aspekt av mikrobiell fermentering. Till skillnad från cellkulturer genererar mikrobiell fermentering mer värme, vilket kräver exakt temperaturkontroll vanligtvis inom ±1 eller 2 °C. Överskottsvärme måste avledas effektivt av utrustningen för att förhindra okontrollerade temperaturspikar, vilket kan utgöra betydande utmaningar under storskalig produktion.
Användningen av antibiotika för att selektera bakterier som kan upprätthålla höga uttrycksnivåer av den önskade produkten introducerar en unik uppsättning utmaningar i bakteriell fermentering. Efter behandling är det absolut nödvändigt att ta bort dessa antibiotika, eftersom tillsynsorgan förväntar sig att tillverkarna ska visa att de elimineras effektivt. Detta uppnås ofta genom att använda mycket låga initiala koncentrationer av specifika antibiotika och verifiera deras avlägsnande genom riktade analytiska metoder. Dessutom kan utspädningseffekter observerade under olika reningssteg hjälpa till i denna process. Som svar på dessa utmaningar har utvecklingen av värdsystem som inte är beroende av antibiotika samtidigt som de säkerställer stabilt uttryck blivit ett viktigt mål i produktionen av rekombinanta proteiner och plasmider. Denna innovation förbättrar inte bara överensstämmelse med regulatoriska standarder utan effektiviserar också produktionsprocessen. Att öka plasmidproduktionen utgör en annan utmaning; Att bara öka antalet celler garanterar inte högre plasmidutbyten. Bevarandet av plasmider kan negativt påverka celltillväxten, vilket kräver en noggrann balans mellan optimering av plasmidutbytet och upprätthållande av en adekvat tillväxthastighet. Att uppnå denna jämvikt kan vara komplext och kräver genomtänkta optimeringsstrategier.
En betydande egenskap som påverkar lämpligheten av mikrobiell fermentering för biofarmaceutisk produktion är glykosyleringsförmågan hos specifika mikroorganismer. Till exempel är Escherichia coli (E. coli) begränsad i sin förmåga att utföra posttranslationella modifieringar, medan jäst har förmågan att glykosylera proteiner, om än inte på samma sätt som däggdjursceller. Naturen hos de erforderliga posttranslationella modifieringarna dikterar slutligen valet av värdorganism för produktion. Även om vissa modifieringar kan uppnås genom in vitro-tekniker, är det i allmänhet att föredra att utnyttja värdorganismens cellulära maskineri. Detta tillvägagångssätt möjliggör en mer naturlig och effektiv produktion av biologiska läkemedel. Även om optimering av processparametrar kan förbättra resultaten, kan det inte helt ersätta den valda mikroorganismens inneboende förmåga. Följaktligen framstår E. coli och jäst som effektiva och komplementära system för att producera biomolekyler som inte kräver människoliknande glykosylering.
När det gäller jäsningsprocesser har realtidsövervakning av produktionsparametrar blivit en viktig uppgift för den biofarmaceutiska industrin. Integreringen av Process Analytical Technology (PAT) under fermentering möjliggör identifiering av potentiellt problematiska förändringar i realtid. Denna förmåga underlättar antingen manuella eller automatiserade justeringar för att hålla processen inom ett beprövat driftsområde. Genom att använda PAT kan tillverkare förbättra både framgången och konsekvensen i sina jäsningsprocesser. Detta proaktiva tillvägagångssätt sparar inte bara tid och resurser utan upprätthåller också de högsta kvalitetsstandarderna under hela produktionen.
Att optimera processen för mikrobiell fermentering för proteinproduktion kräver ett noggrant övervägande av vilken typ av organism som används. I vissa processdesigner kan värdorganismen effektivt utsöndra proteinet i fermentationsmediet, vilket underlättar relativt enkel extraktion genom tangentiell flödesfiltrering (TFF) med hjälp av ihåliga fibermembran. Däremot producerar andra processer, såsom de som involverar Escherichia coli (E. coli), proteiner i cytoplasman, antingen som lösliga proteiner eller som olösliga inklusionskroppar. Dessa varierande produktionsmetoder kräver skräddarsydda insamlingsstrategier som är specifika för den produkt som genereras. Proteiner som kvarhålls i cytoplasman kräver fullständig cellys, vilket kan uppnås genom mekaniska metoder som högtryckshomogenisering. Detta tillvägagångssätt bryter effektivt upp cellerna för att frigöra de önskade proteinerna i det omgivande mediet. Omvänt kräver proteiner producerade som olösliga inklusionskroppar ytterligare procedurer för att veckla ut och återvecka för att ge lösliga, korrekt vikta produkter. Dessa extra steg komplicerar inte bara den övergripande processen utan introducerar också risken för kontaminering eller potentiell skada på slutprodukten.
Däremot kräver proteiner producerade som olösliga inklusionskroppar komplicerade upplindnings- och återveckningsförfaranden för att ge lösliga, korrekt vikta produkter. Dessa ytterligare steg komplicerar inte bara den övergripande processen utan riskerar också att införa föroreningar eller potentiellt skada slutprodukten.
Cellinjeteknik framstår som en lovande strategi för att tackla dessa utmaningar genom att fokusera på att förbättra bildandet av korrekt vikta molekyler i celler. Detta tillvägagångssätt kräver dock en skräddarsydd metodik för varje specifik produkt, vilket kräver betydande tid och ansträngning för att välja lämplig värd och utveckla de initiala processerna. För att uppnå optimala titrar och skördar är det avgörande att noggrant välja den mest lämpliga organismen, uttryckssystemet, operativa sekvensen och förhållandena redan från projektets start.
Mångfalden av jäsningsprocesser och de olika molekylerna de producerar komplicerar skapandet av universella mikrobiella jäsningsplattformar. Att utveckla en mångsidig cellinje och plasmidplattform som effektivt kan användas för specifika typer av proteiner eller produkter skulle representera ett betydande framsteg när det gäller att ta itu med stora utmaningar inom fermentering. Att anta ett plattformsbaserat tillvägagångssätt för efterföljande bearbetningssteg kan dessutom hjälpa till att standardisera vissa aspekter av dessa produktionsprocesser. Även om plattformslösningar för plasmid-DNA-produktion vinner dragkraft, kräver dessa tillvägagångssätt fortfarande flexibilitet för att rymma olika plasmider och format.
Ett annat viktigt fokusområde inom området för mikrobiell jäsning är konsekvensen mellan alla inblandade parter. Tillsynsmyndigheter har fastställt tydliga riktlinjer för att utveckla jäsningsprocesser som följer stränga kvalitetskrav. Detta inkluderar en omfattande förståelse av systemet och dess funktionalitet, samt identifiering av designutrymmet inom vilket jäsning kan ske.
Ett systematiskt tillvägagångssätt är väsentligt för design och optimering av fermenteringsprocesser. Detta innebär att utföra experimentell forskning för att utforska interaktionerna mellan cellinjer och odlingsförhållanden, såväl som deras inverkan på produkttillväxt och avkastning. Mycket av arbetet relaterat till processutveckling och karakterisering kan effektivt modelleras med hjälp av små fermentorer i laboratoriemiljöer.
Att anpassa laboratoriemodeller till de som används vid tillverkning är avgörande för att finjustera processer och säkerställa pålitlig prestanda i stor skala. Men att upprätthålla konsistens över olika parametrar kan visa sig vara utmanande, särskilt för kritiska faktorer som koncentration av löst syre. Därför är det viktigt att noga överväga vilken typ av tank som används för att optimera överensstämmelse mellan modellerna.
Att matcha småskaliga och storskaliga modeller gör det möjligt för forskare att undersöka avvikelser från normala förhållanden, vilket påskyndar analysen av processkonsistens och variabilitet samtidigt som kostnaderna minskar. Laboratoriemodeller fungerar som värdefulla verktyg för att identifiera råvaror och bedöma risken för variation genom produktionscyklerna.
Det är viktigt att notera att optimeringen av fermenteringsreaktioner inte bör fokusera enbart på utbyte; processtillförlitlighet, konsistens och andra kritiska egenskaper – inklusive syrenivåer och syretransport – är lika viktiga. Utformningen av jäsningsprocessen bör ta hänsyn till förväntade målutbyten och de slutliga målen för jäsning för att förhindra skalbarhetsproblem.
