Escherichia coli (E. coli) est largement utilisé dans les procédés de fermentation industrielle pour la production de protéines recombinantes. Une fermentation réussie nécessite un contrôle précis de divers paramètres, notamment le débit d’alimentation, la teneur en oxygène, le pH, la température et la composition nutritionnelle. Cet article explore les facteurs clés qui influencent la fermentation d’E. coli et les stratégies pour optimiser l’expression des protéines.
Taux d’alimentation et taux de croissance spécifique
Le débit d’alimentation et le taux de croissance spécifique sont essentiels pour déterminer le taux de production et d’accumulation d’acide acétique, un sous-produit métabolique courant. Ces facteurs ont un impact direct sur la teneur en sucres résiduels du moût de fermentation, ce qui affecte à son tour l’accumulation d’acide acétique. Un contrôle rigoureux du débit d’alimentation et du taux de croissance spécifique permet de minimiser la production d’acide acétique et d’améliorer ainsi l’efficacité de la fermentation.
Contrôle de l’oxygène dissous, du pH et de la température
Le maintien d’un taux optimal d’oxygène dissous et une régulation rigoureuse du pH sont essentiels à une fermentation stable. La vitesse d’apport d’acides et de bases doit être modérée afin d’éviter des fluctuations brutales. La température a également un impact significatif sur l’expression des protéines :
- La fermentation à basse température entraîne souvent une production active de protéines.
- La fermentation à haute température peut conduire à la formation de corps d’inclusion, réduisant la solubilité des protéines.
Sélection du temps d’induction
Le choix d’une période d’induction appropriée est essentiel pour maximiser le rendement protéique. L’induction se produit généralement à la fin de la phase de croissance exponentielle, avec un taux de croissance contrôlé d’environ 0,2. Cette approche :
- Sépare la phase de croissance bactérienne rapide de la synthèse des protéines, évitant ainsi toute interférence entre les deux étapes.
- Assure une biomasse bactérienne stable, optimisant la consommation d’énergie et l’allocation des ressources.
Optimisation du rapport carbone/azote
Le rapport carbone/azote affecte de manière significative la croissance bactérienne et l’accumulation de métabolites :
- L’excès d’azote entraîne une prolifération bactérienne excessive et une augmentation du pH, ce qui peut entraver l’accumulation des métabolites.
- Un apport insuffisant d’azote limite la croissance bactérienne, réduisant ainsi le rendement en protéines.
- L’excès de carbone abaisse le pH et inhibe la croissance bactérienne, tandis qu’un manque de carbone peut provoquer le vieillissement bactérien et l’autolyse.
Le maintien d’un rapport carbone/azote équilibré assure une croissance bactérienne régulière et une synthèse protéique optimale. Si l’autolyse bactérienne se produit régulièrement pendant la fermentation, l’ajustement de ce rapport peut contribuer à rétablir la stabilité.
Contrôle du sous-produit métabolique – l’acide acétique
L’acide acétique est un sous-produit majeur de la fermentation d’E. coli et peut inhiber significativement la croissance et la production de protéines. Des études indiquent que :
- Des concentrations d’acide acétique de 5 à 10 g/L peuvent supprimer la croissance bactérienne et l’expression des protéines.
- Des concentrations supérieures à 12 g/L inhibent complètement l’expression des protéines recombinantes.
Stratégies pour réduire la production d’acide acétique
- Contrôle du taux de croissance : des taux de croissance spécifiques plus élevés entraînent une augmentation de la production d’acide acétique. Le taux de croissance peut être régulé en ajustant la température, le pH et le taux d’alimentation.
- Culture de dialyse : l’utilisation de la technologie de dialyse pendant la fermentation peut éliminer les métabolites nocifs, permettant une culture bactérienne à haute densité et une expression améliorée des protéines recombinantes.
- Contrôle de la concentration en glucose : le glucose, source essentielle de carbone, doit être maintenu à un niveau optimal pour éviter une production excessive d’acide acétique. Les méthodes de contrôle courantes comprennent :
- Méthode du pH constant : elle utilise le pH comme indicateur pour réguler l’apport en glucose. Cependant, cette approche peut introduire des inexactitudes, car les fluctuations du pH peuvent résulter de facteurs autres que le métabolisme du sucre.
- Méthode de mesure constante de l’oxygène dissous : elle surveille les niveaux d’oxygène dissous afin de déterminer quand ajuster la glycémie. Le maintien d’un niveau constant d’oxygène dissous contribue à réguler efficacement la glycémie.
Optimisation de la température
La température optimale pour la fermentation d’E. coli est généralement de 37 °C. Cependant, des ajustements de température peuvent être nécessaires selon les différentes étapes de fermentation :
- des températures plus élevées accélèrent le métabolisme bactérien et la formation de sous-produits, réduisant potentiellement la stabilité des plasmides.
- les températures plus basses ralentissent la croissance mais améliorent le repliement correct des protéines et réduisent les sous-produits toxiques.
Une approche courante consiste à privilégier la croissance bactérienne à une température optimale pendant la phase précoce et à abaisser la température pendant l’induction pour améliorer l’expression des protéines.
Méthodes de culture
La plupart des procédés de fermentation d’E. coli utilisent la culture en lots alimentés, une méthode optimisée qui maintient un environnement de croissance microbienne idéal. Cette technique offre de nombreux avantages :
- prévient l’inhibition du substrat causée par des concentrations initiales excessives de nutriments.
- évite l’épuisement des nutriments essentiels, assurant une croissance cellulaire et une production de protéines constantes.
- permet une alimentation contrôlée des composants essentiels, optimisant la biomasse et le rendement.
La culture en lots alimentés est devenue une pratique standard dans la fermentation à grande échelle, soutenant la production efficace de produits protéiques biologiques et recombinants.
Conclusion
L’optimisation de la fermentation d’E. coli implique un contrôle précis de multiples facteurs, notamment le débit d’alimentation, la teneur en oxygène, le pH, la température et la composition nutritionnelle. Une gestion efficace de ces paramètres permet de maximiser le rendement protéique tout en minimisant les sous-produits métaboliques tels que l’acide acétique. La mise en œuvre de stratégies telles que l’alimentation contrôlée en glucose, la culture sous dialyse et la modulation de température garantit un processus de fermentation stable et efficace. Grâce aux progrès de la recherche, le perfectionnement des techniques de fermentation continuera d’améliorer l’évolutivité et la productivité des bioprocédés à base d’E. coli.
